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Protocol for using the ChemoTx® System

ChemoTx® 一次性趨化系統(tǒng) ChemoTx 系統(tǒng)是標(biāo)準(zhǔn)微孔板格式的一次性趨化/細(xì)胞遷移室，96 孔或 384 孔。它與大多數(shù)熒光和密度測(cè)定酶標(biāo)儀，以及大多數(shù)液體分配機(jī)器人兼容。目前有 3 個(gè)平板可用，2 個(gè)為 96 孔板，微孔體積為 30 或 300µ，1 個(gè)為 384 孔板，微孔體積為 10µ。均由組織培養(yǎng)級(jí)透明聚苯乙烯制成。聚碳酸酯軌道蝕刻 (PCTE) 過(guò)濾器粘合到金屬框架上，并在每個(gè)測(cè)試部位周?chē)x擇性地涂上疏水掩模。這種面罩允許將細(xì)胞懸液直接移液到過(guò)濾器頂部的位點(diǎn)上，在那里它呈半球形液滴，從而消除了上層孔的需要。過(guò)濾器底部和板邊緣之間的密封也由疏水面罩提供，消除了墊圈和夾緊硬件。通過(guò)這種設(shè)計(jì)，頂部和底部液體中的氣泡截留小化：在頂部，因?yàn)闆](méi)有“孔”截留氣泡；在過(guò)濾器下方，因?yàn)榭走吘壓瓦^(guò)濾器底面之間的密封是水密封，而不是蒸汽密封，因此氣泡可能逸出。

使用 Neuro Probe 96 孔 ChemoTx® 系統(tǒng)填充微孔板的方案 ChemoTx®96 孔微孔板含有 30µL 或 300µL 液體。使用 300µL ChemoTx® 板時(shí)，請(qǐng)參考括號(hào)中的體積。移液器，尤其是多通道移液器實(shí)際分配量的變化可能相當(dāng)大。為了幫助彌補(bǔ)這一點(diǎn)，ChemoTx® 微孔板設(shè)計(jì)有碟形邊緣。這種微孔邊緣設(shè)計(jì)允許每個(gè)微孔中的體積在 27µL-31µL (295µL-303µL) 之間，且結(jié)果良好。相應(yīng)地，將移液器設(shè)置為 29µL (299µL)，以便即使在遞送體積變化±2µL (±4µL) 后，您仍處于正確范圍內(nèi)。當(dāng)微孔中的體積在 27-29µL (295-299µL) 之間時(shí)，應(yīng)用后過(guò)濾器下似乎會(huì)截留氣泡。從上方觀察時(shí)，微孔將是這樣的：然而，這不是一個(gè)捕獲的氣泡。孔邊緣和過(guò)濾器底部之間的密封僅為水封，而非空氣密封。因此，當(dāng)用移液器將細(xì)胞懸液吸取到過(guò)濾器頂部時(shí)，1-2μl 培養(yǎng)基 (1-5μl) 可流經(jīng)過(guò)濾器并置換空氣

過(guò)度灌裝如果微孔過(guò)度灌裝，應(yīng)用過(guò)濾器迫使過(guò)量液體溢出邊緣并破壞水性密封件。然后，當(dāng)您將細(xì)胞懸液添加到過(guò)濾器頂部時(shí)，孔可能會(huì)泄漏。下圖表示過(guò)度填充微孔的后果：n 填充不足如果您向微孔中移取的液體太少，過(guò)濾器的底面將不會(huì)接觸液體。這可防止細(xì)胞懸液與微孔板中的液體接觸，并捕獲孔中的空氣，防止擴(kuò)散和遷移。n 故障排除我們建議您的移液器初始設(shè)置為 29µL (299µL)。然而，由于每個(gè)移液器不同，您可能需要優(yōu)化移液器設(shè)置。填充一列孔并應(yīng)用過(guò)濾器。查看過(guò)濾器頂面，查看過(guò)濾器與孔中液體接觸區(qū)域周?chē)欠裼懈稍锏沫h(huán)狀物。如果微孔中的液體與過(guò)濾器之間沒(méi)有接觸，則它們被填充不足。如果有液體溢出邊緣的井，則它們被過(guò)度填充。調(diào)整移液器設(shè)置，以補(bǔ)償這些問(wèn)題的出現(xiàn)。如果您正在使用多通道移液器，并且您在同一列中同時(shí)存在這兩個(gè)問(wèn)題，則：a）一個(gè)或多個(gè)吸頭與移液器之間存在泄漏；b）一些吸頭上的污染導(dǎo)致液體分配不均；c）您的移液器太不準(zhǔn)確，無(wú)法與 ChemoTx® 配合使用，或 d）上述幾項(xiàng)。如果 a），重新固定移液器吸頭；如果 b），加載新的干凈吸頭；如果 c）或 d），嘗試使用不同的移液器。

如果在幾個(gè)微孔上偶爾發(fā)生輕微填充不足，可以通過(guò)使用干凈的圓形末端玻璃攪拌棒（或類(lèi)似儀器）輕輕向下推動(dòng)過(guò)濾器頂部，直至過(guò)濾器與液體接觸來(lái)克服。一旦接觸，當(dāng)在過(guò)濾器頂部移液時(shí)，細(xì)胞懸液中的液體將取代微孔頂部的空氣。質(zhì)控品除正常陰性質(zhì)控品外，我們還建議將已知使用的細(xì)胞懸液系列稀釋液移液到一行或一列孔中。在這些微孔上方的過(guò)濾部位，請(qǐng)勿移取細(xì)胞懸液。在這些孔中移取與過(guò)濾器頂部位置相同體積的液體為方便。如果您正在使用 30µL 微孔板上具有 5.7 mm 微孔位點(diǎn)的過(guò)濾器，則必須對(duì)該技術(shù)進(jìn)行體積調(diào)整。讀取平板讀數(shù)時(shí)，該連續(xù)稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)或度量，與實(shí)驗(yàn)孔讀數(shù)進(jìn)行比較。例如，如果實(shí)驗(yàn)中每個(gè)位點(diǎn)使用 10000 個(gè)細(xì)胞，則吸取 10000 個(gè)細(xì)胞到 A1 中，5000 個(gè)細(xì)胞到 B1 中，2500 個(gè)細(xì)胞到 C1 中，…，78 個(gè)細(xì)胞到 H1 中。定位濾器并添加細(xì)胞懸液當(dāng)微孔板上加載化學(xué)引誘物和對(duì)照物時(shí)，將有框?yàn)V器置于其上方，并將濾器框架角落的孔與微孔板上的四個(gè)針頭對(duì)齊。確過(guò)濾器上的 A1 位點(diǎn)位于微孔板上的 A1 孔上。向下用力按壓框架的四個(gè)角，直到其緊貼在微孔板邊緣。注意框架必須與板的周緣接觸才能正常工作。（參見(jiàn)上述照片。）
 

有框?yàn)V波器也有兩種配置。直徑為 3.2 mm 的部位暴露面積為 8 mm2，而直徑為 5.7 mm 的部位暴露面積為 25 mm2如果您使用的是 3.2 mm 的位點(diǎn)，則用移液器吸取 20µL-25µL 細(xì)胞懸液至每個(gè)位點(diǎn)（上述推薦的任何連續(xù)稀釋孔除外）。如果您使用的是 5.7 mm 部位，則移取 50µL-60µL 細(xì)胞懸液。垂直握住移液管，緩慢均勻地?cái)D出細(xì)胞懸液。我們推薦一種作用緩慢、平穩(wěn)的移液器；電子多通道移液器是該應(yīng)用的理想選擇。請(qǐng)使用這些面積和體積數(shù)據(jù)，結(jié)合下表中的孔隙密度，確定待加載的適當(dāng)細(xì)胞數(shù)量和適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度。孔徑孔隙密度 2µm 2 x 104 孔/mm2 3µm 2 x 104 孔/mm2 5µm 4 x 103 孔/mm2 8µm 1 x 103 孔/mm2 10µm 1 x 103 孔/mm2 12µm 1 x 103 孔/mm2 讀取 ChemoTx® 過(guò)濾器和微孔板孵育后，取下蓋子，過(guò)濾器仍在原位，取出細(xì)胞懸液。這可以通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)室濕巾吸干來(lái)完成。然后用小刮匙型細(xì)胞收集器或棉簽輕輕擦拭過(guò)濾器頂部的細(xì)胞。在水槽或容器上以 45° 的角度固定微孔板和連接的過(guò)濾器，并使用介質(zhì)小心沖洗過(guò)濾器的頂面。將培養(yǎng)基應(yīng)用于過(guò)濾器的頂部邊緣，并使其輕輕流過(guò)過(guò)濾器表面。目標(biāo)是從頂面去除未遷移的細(xì)胞，而不干擾已通過(guò)過(guò)濾器遷移的細(xì)胞。