paratechs 50010說(shuō)明書
 

Nitrate Reductor Kit 50010
 

　　50010
 

　　該設(shè)備可用于使用單個(gè)一次性微孔板分析生理液中的硝酸鹽作為亞硝酸鹽，用于還原過(guò)程和 Griess 反應(yīng)比色測(cè)定。Reductor 在涉及體內(nèi)一氧化氮產(chǎn)生的生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。
 

　　該設(shè)備還應(yīng)用于農(nóng)業(yè)研究、土壤測(cè)試和環(huán)境監(jiān)測(cè)。
 

　　昂貴的一次性硝酸鹽分析套件被可重復(fù)使用的設(shè)備取代，適用于分析數(shù)千個(gè)樣品。
 

　　常規(guī)執(zhí)行 ELISA 測(cè)試程序的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該已經(jīng)擁有必要的設(shè)備和用品，并且只需要購(gòu)買 Reductor 即可獲得比幾乎任何其他分析系統(tǒng)更有效地執(zhí)行硝酸鹽分析的能力。
 

　　幾乎可以在任何樣品基質(zhì)中成功分析硝酸鹽。
 

　　引用出版物中描述的標(biāo)準(zhǔn)添加方法協(xié)議允許在一次操作中準(zhǔn)確建立水標(biāo)準(zhǔn)與統(tǒng)計(jì)得出的樣品濃度的關(guān)系。因此可以很容易地確定對(duì)給定矩陣的方法的絕對(duì)準(zhǔn)確度的評(píng)估。
 

　　使用其他市售硝酸鹽分析套件時(shí)，每次分析的費(fèi)用從幾美元減少到使用 ParaTechs Reductor 時(shí)只需幾美分。
 

　　不再需要昂貴的專用儀器，例如連續(xù)流分析儀。除了準(zhǔn)確的移液技能外，執(zhí)行分析只需要很少的專業(yè)知識(shí)。
 

　　減速器沒(méi)有活動(dòng)部件，分析不需要啟動(dòng)時(shí)間。試劑制備簡(jiǎn)單，可長(zhǎng)期穩(wěn)定使用。
 

　　使用多個(gè)還原器，用于硝酸鹽分析的每日實(shí)驗(yàn)室吞吐量?jī)H受應(yīng)用于該任務(wù)的個(gè)人數(shù)量的限制。
 

　　硝酸鹽還原劑說(shuō)明
 

　　有可能的使用
 

　　ParaTechs Nitrate Reductor 旨在促進(jìn)對(duì)各種樣品基質(zhì)中的硝酸鹽進(jìn)行分析，包括血清、尿液、天然水以及土壤和植物組織的提取物。該裝置由 96 個(gè)單獨(dú)的鍍銅鎘針組成，用于在一次性微孔板的所有孔中同時(shí)將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。還原完成后，加入 Griess 試劑，并使用酶標(biāo)儀進(jìn)行最終比色測(cè)定。
 

　　需要分析儀器
 

　　可調(diào)諧酶標(biāo)儀(或帶有 540 nm 濾光片的儀器)；超聲波清洗機(jī)；滴定板搖床；單道和多道移液器；酸堿度計(jì)；渦流混合器。當(dāng)使用集束管 (Fisher Scientific) 制備樣品進(jìn)行分析時(shí)，離心機(jī)(例如，帶有 A-2-DWP 轉(zhuǎn)子的 Eppendorf 5810 型)對(duì)于某些應(yīng)用也是不可少的。
 

　　重要的
 

　　ParaTechs Nitrate Reductor 用作一組 Cu-Cd 微型電池，具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽所需的電壓。然而，在鍍銅過(guò)程中，Reductor 將無(wú)法正常工作，并且使用高濃度硝酸鹽激活以增加反應(yīng)表面積已成功完成。每個(gè)新的 Reductor 都在我們的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了部分預(yù)處理，但仍 必須在酸性清潔溶液中超聲處理 2 分鐘，然后在進(jìn)行校準(zhǔn)檢查之前用高濃度的硝酸鹽進(jìn)一步活化 (見(jiàn)下文)。初始調(diào)節(jié)后，隨著銅涂層變得更加穩(wěn)定，還原劑的性能將有所提高。然而， 每次使用 Reductor 時(shí)都必須執(zhí)行 60 秒的超聲處理步驟。  鎘針上的活性還原位點(diǎn)將被氧化鎘阻塞，因?yàn)樵诿看问褂煤笞屵€原劑干燥。
 

　　處理
 

　　Reductor 可重復(fù)用于數(shù)千個(gè)樣品，而不會(huì)顯著降低效率。多次使用 (40-60+) 后，鎘針會(huì)在液-氣界面處被腐蝕，并且針可能會(huì)在超聲波清洗過(guò)程中開(kāi)始折斷。 建議在每次銷售時(shí)購(gòu)買兩個(gè)減速器，以便始終提供備用設(shè)備. 還原器已在我們的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了預(yù)處理，但是，在首使用之前，必須在硫酸銅的鹽酸溶液(2 mL 2.0% CuSO4/175 mL 1.0 M HCl)中超聲處理 2 分鐘以激活還原器。該溶液可以裝在提供的可密封塑料盒中，該塑料盒裝在超聲波清潔器內(nèi)。激活過(guò)程用于增加減速器引腳的反應(yīng)表面積并啟動(dòng)鍍銅過(guò)程。超聲處理后，Reductor 用 DI 水沖洗，用紙巾擦干，然后安裝到含有 20 µL 200 µg/ml 硝酸鹽-N 溶液和 200 µL 標(biāo)準(zhǔn) pH 8.5 氯化銨緩沖溶液的微孔板上(見(jiàn)下文)。然后將該組件搖動(dòng)一小時(shí)。下一個(gè)，用 DI 水*沖洗 Reductor，然后放回酸洗溶液中 60 秒。最后，將還原器沖洗干凈，吸干水分，然后放入提供的包含 pH 8.5 氯化銨緩沖液的托盤 (Nunc Omintray) 中。然后執(zhí)行校準(zhǔn)檢查。
 

　　校準(zhǔn)檢查
 

　　在開(kāi)始實(shí)際樣品分析之前，應(yīng)驗(yàn)證每個(gè)新 Reductor 的精度。在歸約過(guò)程中，所有引腳的行為都應(yīng)相同。應(yīng)使用基本分析程序(如下所述)分析 96 份相同標(biāo)準(zhǔn)溶液(即 5.0 µg/mL NO3-N)。所有產(chǎn)生的光密度都應(yīng)在移液誤差范圍內(nèi)(即 ±3%)。  注意：當(dāng)使用多道移液器添加標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，吸頭組應(yīng)在使用前潤(rùn)濕并至少更換兩次，以避免引入移液錯(cuò)誤。
 

　　分析前樣品制備
 

　　可以使用 Reductor 分析具有簡(jiǎn)單基質(zhì)(例如天然水或土壤的氯化甲提取物)的樣品，而無(wú)需考慮樣品制備。只需將校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的基質(zhì)與樣品基質(zhì)匹配并提供足夠的還原時(shí)間。然而，在分析具有復(fù)雜基質(zhì)的樣品時(shí)，不可能與水標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行密切匹配。例如，生理液體和一些含有低水平硝酸鹽的植物組織提取物不能被充分稀釋以抵消基質(zhì)成分對(duì)還原過(guò)程的影響，或在還原成亞硝酸鹽完成后對(duì)格里斯反應(yīng)化學(xué)的影響。因此，需要在開(kāi)始分析之前盡可能地去除這些物質(zhì)。Somogyi試劑(NaOH/ZnSO4)的使用，如下所述，可能有助于緩解此問(wèn)題。在說(shuō)明末尾的參考資料中可以找到對(duì)這些問(wèn)題的更完整討論。
 

　　分析試劑 (有關(guān)具體制備說(shuō)明，請(qǐng)參閱下面的參考資料。)
 

　　1. 酸洗溶液 2 mL 2% CuSO4·5H2O 的 175 mL 1M HCl。
 

　　2. 1% NH4Cl 緩沖液 pH 8.5。
 

　　3. 1% NH4Cl 緩沖液，pH 10.0。
 

　　4. Griess 試劑庫(kù)存#1。去離子水中的 0.1% N(1-萘基) 乙二胺2鹽酸鹽 (NED)。
 

　　5. Griess 試劑庫(kù)存#2。1.0% 磺胺的 3M HCl 溶液。
 

　　6. Griess 試劑庫(kù)存#3。1.0% 磺胺的 6M HCl 溶液。
 

　　7. Somogyi 試劑溶液#1。0.300M NaOH。
 

　　8. Somogyi 試劑溶液#2。5.00% w/v 的 ZnSO4·7H2O 在 DI 水中的溶液。
 

　　9. 經(jīng)認(rèn)證的 1000 mg/L NO3-N 儲(chǔ)備溶液(Fisher Scientific)。
 

　　基本分析程序
 

　　1.  每次使用Reducor都必須執(zhí)行此步驟。 Reductor 用 DI 水沖洗，放入酸洗液中，超聲處理約 60 秒以去除表面氧化。
 

　　2. 然后用 DI 水沖洗 Reductor，并在紙巾上吸干。此外，在分析過(guò)程中，附著在設(shè)備底部的任何液體都可能會(huì)滲入樣品中，因此必須使用 Q-tip 或折疊紙巾將其清除。然后將該裝置放置在包含標(biāo)準(zhǔn) pH 8.5 氯化銨緩沖溶液的托盤 (Nunc Omnitray) 中，小心僅將針浸沒(méi)，同時(shí)保持底部干燥。
 

　　3. 對(duì)于水樣或土壤的 KCl 提取物，在樣品基質(zhì)中制備標(biāo)準(zhǔn)品。20 µL 等分試樣通常會(huì)產(chǎn)生 0-5 µg/mL NO3-N 范圍內(nèi)的線性校準(zhǔn)曲線。但是，可以根據(jù)需要通過(guò)改變等分體積來(lái)調(diào)整范圍。
 

　　4. 開(kāi)始分析時(shí)，通常將 20 µL 等份樣品移液到微孔板 (Nunc) 中，然后加入 200 µL pH 8.5 氯化銨緩沖液。
 

　　5. 將微孔板放在滴定板振蕩器上。將 Reductor 從托盤中提起，在紙巾上吸干，并用鎖定銷固定在微孔板上。調(diào)整搖床速度設(shè)置，使不會(huì)發(fā)生溢出(即 6.5)。然后通過(guò)搖晃約 60 分鐘將硝酸鹽定量還原為亞硝酸鹽。
 

　　6. 當(dāng)樣品搖晃時(shí)，Griess 試劑可以通過(guò)混合等體積的儲(chǔ)備溶液#1 和#2 來(lái)制備。
 

　　7. 振蕩間隔后，將 Reductor 從微孔板中提起并用 DI 水*沖洗。如果要立即重新使用 Reductor，則可以重復(fù)清潔和重新激活程序。否則，應(yīng)讓減速器在紙巾上晾干。
 

　　8. 然后將 60 µL 混合的 Griess 試劑加入到含有樣品和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的微孔板中，并置于滴定板振蕩器上 5 分鐘以完成顯色。
 

　　9. 最后，通過(guò)在酶標(biāo)儀上測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在 542 nm 處的光密度來(lái)完成分析。
 

　　使用 Somogyi 試劑修改樣品基質(zhì)
 

　　對(duì)于血清、尿液或高度著色的植物組織提取物等基質(zhì)復(fù)雜的樣品，可使用 Somogyi 試劑(NaOH/ZnSO4)與 Zn(OH)2 共沉淀，消除樣品基質(zhì)中的許多干擾物質(zhì)。對(duì)基本程序的進(jìn)一步修改，例如將還原過(guò)程中使用的緩沖溶液的 pH 值提高到 10.0，以及增加混合 Griess 試劑中的磺胺濃度，也將有助于減少干擾。有關(guān)使用標(biāo)準(zhǔn)添加方法的程序驗(yàn)證協(xié)議的討論，請(qǐng)參閱參考資料。
 

　　1. 如果有配備合適轉(zhuǎn)子的離心機(jī)(見(jiàn)上文)，使用 1.2 mL 集束管進(jìn)行分析前基質(zhì)修飾是有效的。首先，將適當(dāng)數(shù)量的空管放置在集束管架中；然后將 300 µL Somogyi Reagent Solution #1 (0.300 M NaOH) 添加到每個(gè)試管中。接下來(lái)，添加 150 µL 樣品，并通過(guò)將液體吸回移液器吸頭并排出至少兩次來(lái)與 NaOH 混合。然后使用單通道移液器添加 300 µL Somogyi 試劑溶液 #2(5.00% w/v 的 ZnSO4·7H2O 的去離子水溶液)，并立即渦旋每個(gè)簇管。這建立了 5 的稀釋系數(shù)。
 

　　2. 將裝滿的簇管架置于冰箱或冰浴中 10 分鐘，讓共沉淀反應(yīng)發(fā)生。然后將簇管架組件以 3700 rpm(最大速度)離心 20 分鐘。得到的上清液應(yīng)該是透明的，沒(méi)有硝酸鹽的損失。
 

　　3. 校準(zhǔn)標(biāo)樣在適當(dāng)范圍內(nèi)的去離子水中制備。對(duì)于血清，典型的操作范圍是 0-2 µg/mL NO3-N(即 0-143 µM)。將處理過(guò)的血清樣品和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的 50 µL 等分試樣移液到 Nunc 微孔板中，并添加 170 µL pH 10 氯化銨緩沖液。
 

　　4. 與 pH 10 的氯化銨緩沖系統(tǒng)一起使用的 Griess 試劑是通過(guò)將 5 mL 等分的儲(chǔ)備溶液 #1 和 #3 添加到預(yù)先稱重的 200 mg 磺胺中來(lái)制備的。可以使用聲處理來(lái)溶解固體。
 

　　5. 還原過(guò)程和最終的比色分析如前所述使用 60 分鐘的還原時(shí)間進(jìn)行。
 

　　煙草植物組織硝酸鹽分析特別說(shuō)明
 

　　煙草植物含有(也許)數(shù)百種可溶性化合物，這些化合物可能在接近中性的 pH 值下與亞硝酸鹽發(fā)生反應(yīng)。這提出了所有使用鎘還原的硝酸鹽分析技術(shù)的共同問(wèn)題。ParaTechs 鎘還原劑在分析過(guò)程中將硝酸鹽 (NO3) 還原為亞硝酸鹽 (NO2)，然后這種 NO2 可能與煙草中發(fā)現(xiàn)的可溶性化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)形成不會(huì)產(chǎn)生顏色響應(yīng)的化合物，因此不會(huì)測(cè)量 NO2 . 可以通過(guò)將氯化銨 (NH4Cl) 緩沖液的 pH 從 8.5 提高到 10.0 來(lái)最小化這個(gè)問(wèn)題。在較高的 pH 值下，亞硝酸鹽的反應(yīng)性較低，因此在還原劑就位時(shí)，大部分 NO2 是穩(wěn)定的。然而，一旦加入 Greiss 試劑，pH 就會(huì)降至 0 以下。
 

　　Greiss 反應(yīng)分兩個(gè)階段進(jìn)行。在第一階段，NO2 與磺胺反應(yīng)，然后該中間產(chǎn)物與 0.1% N-(1-萘基)乙二胺2鹽酸鹽 (NE) 試劑反應(yīng)形成顏色響應(yīng)。在分析煙草組織(和其他植物組織)時(shí)，我們建議在混合顯色試劑中添加超出通常推薦量的額外磺胺。這增加了 NO2 離子在與一些其他化合物發(fā)生反應(yīng)之前遇到磺胺的統(tǒng)計(jì)概率。通常，我們?cè)?10 mL 混合 Greiss 試劑中稱重 200 mg 額外的磺胺。這導(dǎo)致溶液接近飽和，并且已發(fā)現(xiàn)顯著增加計(jì)算的硝酸鹽水平。請(qǐng)注意，要使用的磺胺原液是用 6 N HCl 而不是 3 N HCL 配制的。
 

　　附加信息
 

　　Nitrate Reductor 套件不包括超聲波清潔器。我們發(fā)現(xiàn)“Gemoro 1.2 Quart Ultrasonic Cleaner”品牌是用于在兩次使用之間清潔減速器的有效儀器，并且與提供的酸洗溶液容器兼容。