scarabgenomics C-0742說明書

MDS™42 Chemically Competent Cell Kit

• 維持和繁殖不穩定的克隆和質粒 - 攜帶直接重復序列，反向重復序列或導致明顯的二級“莖 - 環”結構的其他序列的pDNA載體在標準大腸桿菌宿主中通常是不穩定的。CleanGenome® 大腸桿菌菌株經常用于克隆在其他菌株中遭受不需要的重組事件的序列。
• 準確的質粒復制 - 從CleanGenome® 大腸桿菌菌株中刪除了重組或移動DNA元件，如插入元件，以確保您的構建體的忠實復制。
• 克隆和表達“有害”基因 - 清除Genome® 大腸桿菌菌株的自然防御系統，例如IS變異“有害”基因以阻止對生物體的壓力，已被刪除，因此它們不會干擾您的實驗。

背景

使用合成生物學方法，通過進行一系列計劃的，的缺失來減少大腸桿菌K-12基因組。多重缺失系列（MDS™）菌株（1），基因組減少高達15％，通過鑒定非必需基因和消除序列，包括重組或移動DNA和神秘毒力基因，同時保持強勁生長而設計和蛋白質生產。基因組減少還導致意想不到的有益特性，包括高電穿孔效率和重組基因和在其他菌株中不穩定的質粒的準確繁殖。隨后的缺失和有用等位基因的引入產生適合于許多分子生物學應用的菌株。

圖1：多個缺失菌株耐受“有害”基因。 
由霍亂毒素B亞單位（CTX）融合的兔出血癥病毒VP60組成的嵌合基因在大腸桿菌中非常不穩定。單獨地，兩個基因在E中都是穩定的。大腸桿菌HB101，C600和DH10B，但在相同宿主中攜帶融合基因的pCTXVP60不產生融合蛋白，并且以低產率回收。所有回收的質粒都含有CTXVP60開放閱讀框中的突變，幾乎全部來自IS插入。相反，重組質粒在MDS TM中*穩定; 獲得了正常的質粒DNA產量。pCTXVP60的代表性限制性模式。（A）將來自MDS TM 42的質粒DNA轉化并在的宿主中繁殖，然后用NcoI和EcoRI消化。純化每個限制性模式的代表并測序。M，分子量標記，1 kbp階梯; 1，MDS™41，無插入; 2，MDS™42，無插入; 3，DH10B，IS 10插入; 4，DH10B，IS 10插入/缺失; 5，C600，IS5插入; 6，C600，IS1插入; 7，C600，IS 1插入。（B）對于所呈現的五個實例確定的CTXVP60閱讀框中IS元件插入位點的相對位置。

圖2：不同宿主菌株中的質粒穩定性。 
左：在pT-ITR的四次傳代培養期間，具有病毒LTR區段的質粒; 泳道0，傳代培養前分離的質粒DNA，泳道1-4，連續傳代培養。用限制酶消化質粒DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析。KpnI在單個位點切割質粒，但在MG1655中，兩個條帶表明質粒缺失。MscI在兩個位置切割，但在MG1655中，第三個中間帶確認質粒被刪除。右圖：慢病毒表達質粒的四種變體在MDS TM42ΔrecA和Stbl3 TM（Life Technologies）中的穩定性，顯示含有完整質粒的轉化體的比例（表2 BioTechniques 43：466-470（2007年10月））（2）。

試劑盒組分 
MDS™42個化學感受態細胞
的pUC19對照DNA（10微克/微升）
的SOC培養基

基因型 
MG1655多缺失菌株（1）
所述的recA基因 1819突變是Δ的*缺失的recA。
已經在基因組中產生了lacZ M15缺失，以允許使用β-半乳糖苷酶的α-互補片段對質粒中的插入物進行藍/白篩選。

質量控制 
使用pUC19對照DNA測試轉化效率，一式兩份進行。將轉化的細胞接種在含有50μg/ ml羧芐青霉素的LB平板上。轉化效率= 1×10 ⁸cfu /μgDNA。

儲藏條件 
將組件儲存在-80°C。不要將細胞儲存在液氮中。

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