預(yù)期用途

Eagle Biosciences MMAE（單甲基澳瑞他汀E）抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)ELISA檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫分析試劑盒）預(yù)期用于定量測定供試品中的抗體-MMAE-偶聯(lián)物水平。可用于MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)的臨床前和臨床藥理學(xué)研究。

• 來自組織/細(xì)胞培養(yǎng)物的樣本和來自人、大鼠、小鼠、靈長類動物等的血清樣本。可直接與本試劑盒配合使用。
• 基于人源化單克隆抗體的MMAE-ADC和基于小鼠單克隆抗體的MMAE-ADC均可用本試劑盒測定。

試驗原理

Eagle Biosciences MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)ELISA檢測試劑盒的設(shè)計、開發(fā)和生產(chǎn)用于定量測定血清中的抗體一甲基澳瑞他汀E(MMAE)偶聯(lián)物。該測定法采用競爭性免疫分析技術(shù)，抗體僅與一甲基auristatin E結(jié)合。

將分析校準(zhǔn)品（抗體MMAE偶聯(lián)物）和供試血清樣本直接加入包被有特異性抗MMAE抗體的微量滴定板的孔中。隨后，向每個孔中加入辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的MMAE。在孵育期間，抗體MMAE偶聯(lián)物與HRP結(jié)合的MMAE競爭抗MMAE抗體的有限結(jié)合位點。包被良好的“抗MMAE抗體”免疫復(fù)合物

• 形成“HRP偶聯(lián)MMAE”。在隨后的洗滌步驟中除去未結(jié)合的抗體和緩沖液基質(zhì)。為檢測該免疫復(fù)合物，將微孔與底物溶液在定時反應(yīng)中孵育，并用酸性試劑（即ELISA終止液）終止反應(yīng)。然后在分光光度酶標(biāo)儀中測定吸光度。與每個微量滴定孔壁結(jié)合的免疫復(fù)合物的酶活性與供試品中抗體-MMAE結(jié)合物的量成反比。通過在4參數(shù)或?qū)?shù)-對數(shù)曲線擬合上繪制每個校準(zhǔn)品的吸光度與各自抗體-MMAE偶聯(lián)物濃度的曲線，生成校準(zhǔn)曲線。根據(jù)校準(zhǔn)曲線直接測定供試品中抗體-MMAE偶聯(lián)物的濃度。

試劑：制備和儲存

接收后，該人MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)ELISA檢測試劑盒必須在2-8 ℃下儲存。關(guān)于試劑盒的失效日期，請參閱試劑盒包裝盒上的標(biāo)簽。所有組分在失效日期前均保持穩(wěn)定。

使用前使所有試劑恢復(fù)至室溫。不同試劑盒批號的試劑不得合并或互換。

1. 抗-MMAE抗體包被微孔板（產(chǎn)品目錄號編號30748）

一個微孔板上有12 × 8個條帶（共96孔），包被有特異性抗MMAE抗體。將板框定并密封在含有干燥劑的箔拉鏈袋中。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

2. HRP結(jié)合的MMAE（貨號編號30685）

一個小瓶含有3 mL即用型HRP標(biāo)記的MMAE，溶于穩(wěn)定的蛋白基質(zhì)中。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

3ELISA清洗濃縮液（產(chǎn)品目錄號編號10010）

1瓶含30 mL 30倍濃縮液。使用前，必須用870 mL去離子水稀釋內(nèi)容物并混勻。稀釋后，得到含有表面活性劑的工作清洗液，溶于磷酸鹽緩沖鹽水中，其中含有非疊氮化物、非汞防腐劑。稀釋的清洗液可在室溫下儲存，并在試劑盒包裝盒上標(biāo)注的失效日期前保持穩(wěn)定。

4. ELISA HRP底物（貨號編號10020）

一瓶含15 mL四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和*。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

5. ELISA終止液（貨號編號10030）

一瓶含15 mL終止液。本試劑可在2-8 ℃或室溫下儲存，在試劑盒包裝盒上標(biāo)注的失效日期前可保持穩(wěn)定。

6. 抗體-MMAE偶聯(lián)零校準(zhǔn)品（貨號編號30711）

一個裝有30 mL零校準(zhǔn)品(30711)的小瓶。該試劑用于稀釋測定校準(zhǔn)品的校準(zhǔn)儲備液以及稀釋供試品。本試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，在試劑盒包裝盒上標(biāo)注的失效日期前可保持穩(wěn)定。

7. 抗體-MMAE偶聯(lián)校準(zhǔn)儲備液（貨號編號30712）

（試劑盒中未提供-可選）

一瓶(30712)含有抗體-MMAE-偶聯(lián)物的校準(zhǔn)儲備液，溶于含非疊氮化物防腐劑的凍干(0.5 mL)血清基質(zhì)中。標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確濃度參見小瓶。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

安全注意事項

人MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)檢測試劑盒試劑必須在專業(yè)實驗室環(huán)境中使用，僅供研究使用，不得用于診斷程序。僅牛血清試劑來源的原材料來自美國連續(xù)48個國家。僅從獸醫(yī)監(jiān)督下飼養(yǎng)的供體健康動物中獲得，發(fā)現(xiàn)無傳染病。進(jìn)行本試驗時佩戴手套，并將這些試劑視為具有潛在傳染性進(jìn)行處理。避免接觸含有TMB、*或硫酸的試劑。TMB可能會刺激皮膚和粘膜，引起皮膚過敏反應(yīng)。TMB是一種疑似致癌物。硫酸接觸皮膚可能引起嚴(yán)重刺激。請勿接觸眼睛、皮膚或衣服。請勿攝入或吸入煙霧。接觸后，用大量水沖洗至少15 min。使用藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范。

需要但未提供的材料

• 抗體-MMAE偶聯(lián)校準(zhǔn)儲備液（貨號編號30712）
• 能夠遞送25µL、50µL和100µL等體積的精密單通道移液器。
• 重復(fù)適用于遞送100µL的分配器。
• 適用于上述體積分配的一次性移液器吸頭。
• 一次性12 x 75 mm或13 x 100玻璃管或塑料管。
• 帶蓋的一次性100 mL和1000 mL塑料瓶。
• 鋁箔。
• 去離子水或蒸餾水。 

• 塑料微量滴定孔蓋或聚乙烯膜。
• ELISA多通道洗瓶或全自動（半自動）洗滌系統(tǒng)。
• 能夠讀取450/650 nm或450/620 nm處吸光度的分光光度酶標(biāo)儀。

試劑制備

1. 使用前，使所有試劑恢復(fù)至室溫。不同試劑盒批號的試劑不得組合或互換。
2. 使用前，必須將ELISA清洗濃縮液稀釋至工作溶液。詳細(xì)信息請參見試劑章節(jié)。
3. 用0.5 mL去離子水復(fù)溶校準(zhǔn)儲備液30712。使用零校準(zhǔn)品(30711)以1:X*稀釋復(fù)溶校準(zhǔn)儲備液(30712)，以獲得濃度為4µg/mL的水平9校準(zhǔn)品。通過1:2連續(xù)稀釋進(jìn)一步創(chuàng)建校準(zhǔn)品水平八至二，以獲得濃度為2µg/mL、1µg/mL、0.5µg/mL、0.25µg/mL的校準(zhǔn)品。

0.125µg/mL、0.063µg/mL和0.032µg/mL。測定校準(zhǔn)品應(yīng)在2小時內(nèi)使用，并應(yīng)儲存在-20 ℃以下。凍融循環(huán)次數(shù)不得超過3次。

1:X* 1:2 1:2 1:2 1:2 ……

X* = 30712/4的濃度

4. 測試配置

使用抗體-MMAE偶聯(lián)儲備液（產(chǎn)品目錄號編號30712）。為了訂購該校準(zhǔn)品儲備液，請訂購Ab-MMAE結(jié)合儲備液（貨號編號30712）。

試驗程序

1. 將足夠數(shù)量的抗MMAE抗體包被微孔板條/孔置于支架上，以一式兩份運行人抗MMAE標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和未知樣品。
2. 向微孔中加入100µL校準(zhǔn)品和供試品。
3. 牢固密封板孔，用箔或其他材料遮光，在ELISA板振蕩器（小軌道半徑）上以400～450 rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)30 min。
4. 立即向每個孔中加入25 μL HRP標(biāo)記MMAE（目錄號30719）。（注：在加入HRP標(biāo)記的MMAE之前無需進(jìn)行洗滌步驟）
5. 牢固密封板孔，用箔或其他材料遮光，并在ELISA板振蕩器（小軌道半徑）上以400至450 rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)2 h±10 min。
6. 向各孔中加入350µL工作清洗液，清洗各孔5次，然后*吸出內(nèi)容物。或者，可以使用自動微孔板洗板機。
7. 向各孔中加入100µL ELISA HRP底物。
8. 用鋁箔或其他材料覆蓋微孔板，避免暴露于光照下。將平板在室溫下靜置孵育20 min。
9. 立即向每個孔中加入100µL ELISA終止液。輕輕混合。
10. 讀取450 nm處的吸光度。

程序注釋

1. 建議所有校準(zhǔn)品和未知樣本重復(fù)測定兩次。每份重復(fù)樣本的平均吸光度讀數(shù)應(yīng)用于數(shù)據(jù)簡化和結(jié)果計算。建議在每次檢測中添加外部質(zhì)控品。
2. 將光敏試劑保存在原始琥珀色瓶中。
3. 將任何未使用的抗體包被條儲存在含有干燥劑的箔拉鏈袋中，以防止受潮。
4. 為確保試驗的重現(xiàn)性，必須采用仔細(xì)的技術(shù)并使用適當(dāng)校準(zhǔn)的移液裝置。
5. 除本說明書中規(guī)定的孵育時間或溫度外，其他孵育時間或溫度可能影響結(jié)果。
6. 可使用軌道半徑較大（例如 > 1 cm）的軌道混合器，轉(zhuǎn)速為150-200 rpm。
7. 避免微孔中出現(xiàn)氣泡，因為這可能導(dǎo)致較低的結(jié)合效率和較高的重復(fù)讀數(shù)CV%。
8. 使用前，應(yīng)輕輕充分混合所有試劑。避免起泡。
9. 如果該測定適用于自動ELISA系統(tǒng)，如DS-2、DSX或Trituras，如果測定程序有任何修改，則需要進(jìn)行程序驗證。

結(jié)果判讀

建議使用4參數(shù)或log-logit校準(zhǔn)曲線擬合。

1. 計算每對重復(fù)檢測結(jié)果的平均吸光度。
2. 通過縱坐標(biāo)上所有校準(zhǔn)品水平的校正吸光度與校準(zhǔn)品濃度生成校準(zhǔn)曲線。應(yīng)使用適當(dāng)?shù)挠嬎銠C輔助數(shù)據(jù)簡化程序進(jìn)行結(jié)果計算。

使用各自的校正吸光度，從校準(zhǔn)曲線中直接讀取供試品的抗體-MMAE偶聯(lián)物濃度。

示例數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線

給出了人MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)ELISA檢測試劑盒的典型吸光度數(shù)據(jù)和所得標(biāo)準(zhǔn)曲線。不得使用該曲線代替每次試驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線運行。

程序的局限性

1. 本試驗需要血清或血漿樣本進(jìn)行檢測。
2. 不同種屬的血清或血漿樣本可能顯示不同的基質(zhì)背景。可能需要修改試驗程序以測量嚙齒類動物樣本。
3. 對于大于4µg/mL的樣本值，建議使用稀釋液（即，使用零校準(zhǔn)品基質(zhì)的1:10或1:100稀釋液）重新測定樣本。該校準(zhǔn)品零可從試劑盒制造商處獲得。由于基質(zhì)效應(yīng)，使用不同的緩沖液基質(zhì)進(jìn)行樣本稀釋可能會導(dǎo)致假高或假低值。）。分析精密度和檢測結(jié)果位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的15%B/B0至90%B/B0之間。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)樣品在使用前應(yīng)進(jìn)行總結(jié)合率和其他性能標(biāo)準(zhǔn)的驗證。
5. 試劑盒校準(zhǔn)品基于MMAE結(jié)合抗體或ADC濃度。它不是基于游離MMAE濃度。不同連接體和DAR中的MMAE-ADC可能產(chǎn)生不同的曲線偏移。

質(zhì)量控制

為確保結(jié)果的有效性，每次測定均應(yīng)包括適當(dāng)?shù)馁|(zhì)控品。

性能特征

靈敏度

該MMAE ADC EIA的分析靈敏度(LLOD)約為0.0435µg/mL，通過8次零標(biāo)準(zhǔn)品(B0)重復(fù)測定的B0平均值以下的2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差確定。

特異性

該MMAE-ADC EIA未顯示與MMAF-ADC、DM1-ADC和DUO-6-ADC的任何交叉反應(yīng)性。

高劑量“鉤狀”效應(yīng)

該試驗表明，高達(dá)1,000µg/mL的MMAE ADC水平?jīng)]有任何高劑量“鉤狀”效應(yīng)。

精密度

通過測量3個校準(zhǔn)品（L3、L6和L8）的8次重復(fù)測定驗證批內(nèi)精密度。CV%為7.1%、6.7%和11.0%。

使用零校準(zhǔn)品基質(zhì)稀釋兩份樣本并進(jìn)行檢測。MMAE ADC稀釋回收率值結(jié)果如下：

加標(biāo)回收率

將校準(zhǔn)品水平4和6與校準(zhǔn)品水平3、5和7等體積混合并檢測。結(jié)果如下：

1. 100µl校準(zhǔn)品和未知樣本

在ELISA板振蕩器上室溫下孵育30 min

2. 25µl MMAE示蹤劑

在ELISA板振蕩器上室溫下孵育2小時洗滌5次